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  • 上海遠慕生物科技有限公司

    磁珠法核酸提取及常見的6種誤區
    點擊次數:109 發布時間:2022-03-31

     人類對核酸物質的了解始于1869年,這一年Friederich Miescher從白細胞的細胞核中分離出一種他稱之為“核素"的化學物質,這是人類歷史/上/第一次有目的地提取細胞內的核物質,然而當時采用的方法十分簡單,僅僅是通過改變溶液的酸堿度,核酸便從酸性溶液中沉淀出來。這也是最早對核酸性質的描述,即是一種溶于堿性溶液,但不溶于酸性溶液的物質。

    1953年,Watson和Crick闡明了DNA的結構,從此開啟了分子生物學的元年。此后不久,出現了分離核酸的標準實驗室程序。1958年,發現DNA半保留復制原理的Meselson和Stahl開創性地應用密度梯度離心法獲得DNA。這種方法利用離心力場中各組分的浮力密度差不同的原理進行DNA純化。由于銫離子(Cs)相對于水的密度更大,施加到CsCl溶液的超高離心力導至形成密度梯度。核酸在這個梯度上遷移,直到達到中性浮力,即等密度點。該方法具有以低成本提供非常純的高產DNA的優點。

    其它的液相純化方法還包括經典的苯/酚-氯仿法、CTAB法等。

    但直到二十世紀90年代,DNA提取仍然是耗時、繁瑣、低效率的操作。1989年,McCormick建立了一種用酚化的二氧化硅吸附去除蛋白質的基因組DNA提取方法。它類似經典的酚/氯仿提取法,即用酚化的二氧化硅酚代替酚,這是最早出現的固相吸附提取方法。相比起液相抽提,固相吸附法的優勢很明顯,因此傳統的液相分離提取核酸方法逐漸被以固相吸附支持物為基礎的新方法所取代。目前常見固相材料有硅膠、玻璃顆粒、硅藻土、陰離子交換載體等。但固相法通常需采取數次快速離心、真空抽濾等步驟來實現分離,而且對于樣本需求量大,耗費樣品較多,不便于高通量、自動化操作,嚴重限制了在臨床基因診斷領域的應用。

    理想的核酸提取方法應該滿足以下4個條件:

    1)靈敏、快速、簡單、重復性好;

    2)產物純度較高,不影響后續步驟

    3)環保、無毒害

    4)無交叉污染風險

    磁珠法提取

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    為了適應現代分子生物學檢測實驗高通量、高靈敏度、自動化操作的需要,磁珠法應運而生。第一個利用磁珠法提取DNA的并且在美國成功申請專/利的商品化試劑出現在1998年。磁珠法先通過裂解細胞,將游離出來的核酸分子特異地吸附到磁性顆粒表面,而蛋白質、多糖等雜質則留在溶液中;在外加磁場的作用下,磁性顆粒與液體分開,棄除液體后,再經洗脫即得到純化的核酸分子。

    磁珠法利用了磁性顆?;钚曰鶊F在一定條件下可與核酸結合和解離的原理,盡可能地避免了提取過程中核酸的丟失,還能很好地去除標本中存在的干擾物質(如血紅蛋白、膽/紅素及脂血等因素)影響,獲得質量較高的核酸模板。隨著磁珠法提取技術的發展,DNA提取才真正開始實現標準化、快速化和自動化。

    而基于磁珠法提取的商業試劑盒也得到廣泛應用。這種試劑盒不需要任何有機溶劑,無需重復離心,目前可以從全血、血清、血漿、唾液、尿液、糞便、腦脊液、組織和細胞中提取高質量的DNA和RNA,且耗時更短、回收率更高。最顯/著的優勢是可以通過機械設備實現提取過程自動化和無人源干擾。

    近年來分子診斷技術快速發展,隨著基因測序等技術的成熟,成本進一步降低,在臨床上的應用也越來越普遍。分子診斷檢測的樣本類型多達數十種,而處理后產物適用的檢測項目也涵蓋了熒光定量PCR、基因測序、基因芯片、生物質譜等各類分子生物學技術平臺。然而,無論是哪一類檢測項目,準確的檢驗結果無疑依賴于高質量的標本及標本前處理過程。因此臨床分子診斷自動化趨勢將逐步在國內臨床實驗室成為主導,而自動化首先將在目前手工操作較普及且對結果影響最大的核酸提取上實現。磁珠法提取試劑加自動核酸提取儀,就成為解決臨床分子診斷樣品前處理的完/美組合。

    然而,使用生物磁珠提取核酸的過程中,也存在著一些誤區。

    誤區1:磁珠越多,提取效果越好

    有很多老師喜歡在提取效果不佳的時候,增加磁珠的用量,認為磁珠多加一點,就能吸上更多的核酸,不得不說這種想法是不可取的。

    磁珠的主要特點是既可以分散于液體中,也可以在外加磁場作用下以固態方式和液相分離,任何試劑體系,磁珠和液體的比例都應該是有一定閾值的,超過一定的比例,過多的磁珠將因為無法均勻分散于液體中,而喪失其分散的特性,也使得洗滌過程中無法充分增加核酸磁珠和液體接觸的效率。

    而過量的磁珠也會吸附更多的雜質,對于除雜的效果影響非常大。甚至有些時候,過多的磁珠會吸附蛋白酶、溶/菌酶等在液體體系中起主要作用的功能成分,導至整個試劑盒效率低下。有很多時候,在提取效果不佳的時候,減少磁珠使用量,反而是提升提取效果的最優途徑。

    通常情況下,磁珠法試劑盒給出的參考磁珠用量都是略微過量的,因此需要增加磁珠用量改善吸附效率的情況并不多,但如果確定是磁珠用量不足導至的提取效果不好,是可以在一定范圍內通過增加磁珠用量來改善提取效果的。

    誤區2:試劑使用的越多,提取效果越好

    裂解效果不好?多加點裂解液。洗滌效果不好?多加點洗滌液。這是很多客戶在使用試劑盒中的慣性思維。

    但是對于磁珠法而言,每增加一部分液體體積,就減少了更多的磁珠碰撞幾率,而降低磁珠碰撞幾率,會導至吸附率的大幅度下降。所以很多時候,雖然增加裂解液和洗滌液確實能夠起到增強裂解和增強洗滌的作用,但磁珠法提取的核心是磁珠吸附核酸的效率,無法保證磁珠碰撞效率是不能保證核酸提取效率的,所以單純增加試劑使用量改善提取效果并不一定完全有效。

    誤區3:洗滌次數越多,提取效果越好

    提取得到的核酸雜質過多時,使用者會考慮多進行幾次洗滌,以得到更為純凈的核酸。增加洗滌次數確實有利于提純核酸,但考慮到每次洗滌都會損失一定量的核酸,且增加了核酸斷裂水解的可能性,所以一般來說洗滌次數控制在2~4次為宜。

    誤區4:樣本取用的越多,提取效果越好

    在樣本不夠新鮮或者核酸含量本身就很少的情況下,往往核酸提取效果不好,很多老師就會采用多取樣本的方式增加核酸提取量。

    但簡單地增加樣本取樣量,有時會引入過多的雜質,超出裂解液裂解能力,也會使提取效率降低,所以并不推薦通過簡單的增加樣本取樣量的方式來達到增加提取量的目的。

    如果確實是由于樣本量不足而引起的提取量過低,建議在前處理先經過富集或者濃縮步驟再開始提取?;蛘咴黾恿呀獾耐耆?,使更多的核酸暴露出來也是一種解決方法。

    誤區5:某一種磁珠好,就應該在所有試驗中效果都好

    磁珠的種類是多種多樣的,粒徑大小不同,分散性不同,磁響應時間不同,包被基礎基質不同,外層修飾官能團不同,包被密度不同,官能團臂長不同,會導至磁珠特性千差萬別。

    所以不同磁珠所適應的實驗和體系也是不同的。就像同樣是核酸提取的試劑,配方也并不完全相同,同樣應用于核酸提取的磁珠,性質也并非完全一致。

    有的磁珠在常量核酸提取中表現出了更高的吸附效率,有的磁珠更適用于微量核酸提取。有的磁珠適合偏酸性系列的試劑體系,有的磁珠適合偏堿性系列的試劑體系。有的磁珠磁響應性好但是沉降速度快,更適合磁棒式自動提取儀;有的磁珠沉降速度慢但是磁響應時間長,更適合移液式自動提取儀。

    很少有一種磁珠能適用于所有實驗的情況,除了固定的試劑盒配合,多數情況下,磁珠和試劑體系都要做一定時間的配合調整。

    誤區6:和某種試劑盒對比效果不好,就是磁珠不好

    很多客戶在篩選磁珠過程中都是在已經成熟試劑體系下,簡單地等量替換磁珠,用于比較磁珠效果。

    這樣就會很容易得出某種磁珠效果不好的結論,但實際上,由于不同磁珠適合的體系和用量是不同的,往往需要調整過后才能獲得更好的提取效果。

     

     

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